Podsumowanie efektów projektu TEAM TECH CORE Facility POIR.04.04.00-00-2CC8/16. “Mass Spectrometry of Biopharmaceuticals - improved methodologies for qualitative, quantitative and structural characterization of drugs, proteinaceous drug targets and diagnostic molecules.”
Celem projektu było opracowanie i wdrożenie nowych procedur analitycznych spektrometrii mas w różnych dziedzinach, w których specjalizuje się Środowiskowa Pracownia Spektrometrii Mas, IBB PAN. Nowe procedury powiększyły portfolio procedur oferowanych w Środowiskowej Pracowni Spektrometrii Mas, IBB PAN i są one dostępne dla wszystkich badaczy z szeroko pojętego obszaru badań biomedycznych.
W dziedzinie badań proteomicznych w toku trwanie projektu opracowano i wdrożono szereg nowych typów analiz: FAIMS, DIA, SureQuant, protokół postępowania w analizach komercyjnych osocza, nowe metody normalizacji, są one rutynowo używane w prowadzonych analizach:
- Analiza modyfikacji potranslacyjnych białek. Rozwijano metody pomiarowe z wykorzystaniem modułu FAIMS Pro interference (Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry) pod kątem analizy modyfikacji potranslacyjnych - fosforylacji, selenowych analogów metioniny i cysteiny oraz homocysteinylacji. Wykazano m.in., że zastosowanie modułu FAIMS umożliwia ponad dwukrotne zwiększenie liczby identyfikowanych fosfopeptydów. Opracowane metody do tej pory wykorzystano do analizy próbek pochodzących z hodowli komórek eukariotycznych, tkanek roślinnych i zwierzęcych. Należy zwrócić uwagę, że zastosowanie Ion Mobility nie zwiększa kosztów eksperymentów proteomicznych, pozwalając na uzyskanie pogłębionej wiedzy na temat modyfikacji potranslacyjnych w badanym materiale.
- DIA. Opracowany protokół analiz typu DIA (Data Independent Analysis) wprowadzono do wachlarza metod wykorzystywanych w Pracowni w roku 2021. W ostatnim czasie skupiono się na wykorzystaniu tej metody do prowadzenia analiz nacelowanych na wąską grupę białek lub peptydów, jako alternatywy do analiz typu PRM. Ze względu na znacznie niższy koszt DIA w porównaniu do analiz celowanych z wykorzystaniem standardów izotopowych, możliwe było wykonanie tego typu badań dla partnerów naukowych z ograniczonym budżetem oraz czasem przeznaczonym na analizy proteomiczne. Ponadto, zastosowano metodę DIA do wielkoskalowych badań peptydów bioaktywnych wytwarzanych w toku endogennego trawienia białek o znaczeniu klinicznym. Jest to znaczące osiągnięcie, ponieważ żadna z poprzednio stosowanych w Pracowni metod nie pozwalała na przeprowadzenie tego typu analiz, ze względu na niski poziom badanych produktów peptydowych, przy jednoczesnej mnogości ich wariantów.
- Wdrożenie typu akwizycja SureQuant pozwala na ilościową analizę nawet 800 peptydów w ramach pojedynczego pomiaru, co znacząco redukuje koszty i czas potrzebny na przeprowadzenie eksperymentu oraz sprawia, że spektrometria mas może być metodą konkurencyjną do analiz immunochemicznych takich jak Luminex. W najbliższym czasie planowane jest wykorzystanie akwizycji SureQuant do analizy ilościowej osocza pochodzącego od pacjentów z padaczką oraz do badania profilu chemokin w hodowlach tkanek rakowych.
- Poszerzono wachlarz dostępnych analiz globalnych opartych na znakowaniu izobarycznym. Dzięki rozbudowie parku maszynowego Pracowni w ostatnim roku możliwe było wprowadzenie znaczników TMTpro 16-plex i 18-plex oraz wykorzystanie ich do przeprowadzenia analiz proteomicznych w ramach 12 projektów z różnych obszarów nauk biologicznych i medycznych. Zgodnie z naszą wiedzą na tą chwilę Pracownia jest jedynym ośrodkiem w Polsce przeprowadzającym na taką skalę tego typu analizy komercyjnie i w ramach współprac naukowych.
- Wprowadzenie nowych metod przygotowania próbek i analizy danych. Doświadczenia z poprzednich lat oraz rozwój naukowy zespołu umożliwiły wdrożenie nowych metod preparatywnych i poszerzenie wachlarza oferowanych usług. W ostatnim czasie m.in. wprowadzono nowe metody lizy próbek trudnych (skóra, organy, materiał kopalny) z wykorzystaniem zakupionego w ramach projektu urządzenia Precellys Evolution. Ponadto opracowano protokoły postępowania z próbkami zanieczyszczonymi substancjami niekompatybilnymi z analizą LC-MS, co pozwoliło na eliminację znacznej części przestojów w pracy laboratorium spowodowanych kontaminacją sprzętu. Ze względu na rosnące zainteresowanie środowiska medycznego analizami proteomicznym zoptymalizowano również metody przygotowania próbek osocza. Wprowadzono immunodeplecję jako usługę standardowo oferowaną przez Pracownię oraz opracowano metody powtarzalnego przygotowania i pomiaru tego materiału o nieocenionym potencjale diagnostycznym. Nowe procedury posłużyły już do analiz prowadzonych we współpracy z lekarzami prowadzącymi badania naukowe w dziedzinie epilepsji, ginekologii i kardiologii. Poszerzono listę o nowe metody analizy danych proteomicznych z zastosowaniem platform własnych (MScan), ogólnodostępnych (MaxQuant, Perseus, Skyline, DIA-NN, pakiet Bioconductor) oraz komercyjnych (Proteome Discoverer, Spectronaut, SpectroDive). W ostatnim czasie w ramach prowadzonych analiz wykorzystano m.in. nowe metody normalizacji danych takie jak algorytmy ComBat i Limma w celu redukcji wpływu technicznych źródeł wariancji danych na efekt analizy. Aby zwiększyć świadomość środowiska naukowego na temat metod proteomicznych i ich zastosowania Pracownia organizuje bezpłatne seminaria online.
- Metoda analiz ilościowych przeciwciał terapeutycznych z zastosowaniem techniki PRM. Zwalidowana na próbkach trzech preparatów terapeutycznych Trastuzumab, Rituximab, Pertuzumab w oparciu o zestaw 29 specyficznych i niespecyficznych peptydów zsyntetyzowanych w formie znakowanej izotopowo i służących jako standardy wewnętrzne. Pozwala na ilościową analizę tych leków płynach ustrojowych.
W dziedzinie badań metabolomicznych w toku projektu zoptymalizowano i wdrożono procedury oparte na technice homogenizacji jako wstępnym etapie obróbki próbek tkanek zwierzęcych i ludzkich i są one rutynowo wykorzystywane do prowadzani analiz, także dla użytkowników zewnętrznych:
- Panel krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i panel pochodnych trimetyloaminy w homogenatach tkanek zwierzęcych (mózg, wątroba, serce, nerki, płuc, jelita) jako metody badające metabolom mikroflory jelitowej wykorzystywane są w różnych dziedzinach medycyny (aplikowane do kardiologii, pediatrii, gastroenterologii, okulistyki, dermatologii, onkologii). Klienci, którzy korzystali i korzystają to: prof. Olek (AWFiS Poznań), prof. Ufnal (WUM), prof. Paziewska (UPH Siedlce).
- Panel średnio- i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych w osoczu i homogenatach wątroby - metoda rozszerzona o dwa kwasy na potrzeby oznaczeń w mleku ludzkim. Badania wykonywane m.in. dla prof. Michała Mikuli (Centrum Onkologii) oraz dr Wesołowskiej (WUM)
- Aminokwasy w osoczu i homogenatach tkanki mózgowej i neuroprzekaźniki w homogenatach tkanki mózgowej - metody stale uzupełniane o nowe anality, które są interesujące dla klientów. Dodatkowo zaaplikowano metodę oznaczania neuroprzekaźników do oznaczeń w innych matrycach niż tkanka mózgowa - z powodzeniem w osoczu. Metoda wykorzystywana przez klientów w badaniach zaburzeń neuropoznawczych (dr Hamed – Inst. Nenckiego, prof. Dziembowska - CENT UW)
- Karnityna wolna i całkowita w osoczu i homogenatach mięśnia szkieletowego - rozszerzono panel o acylokarnityny jako uzupełnienie frakcji wolnej karnityny (osocze, a w przyszłości w tkance mięśniowej)
- Simwastatyna w osoczu i homogenatach tkanki mięśniowej - wykonano oznaczenia m.in. dla prof. Łobody.
- oznaczanie wolnej i związanej frakcji leku z użyciem enzymu B-glukuronidazy. Enzym ten uwalnia frakcję leku związana z kwasem glukuronowym i pozwala na oznaczenie całkowitej puli leku. Po odjęciu wyniku uzyskanego bez użycia enzymu (czyli frakcji wolnej) uzyskuje się stężenie leku we frakcji związanej. Komercyjnie wykorzystano tę procedurę do oznaczania frakcji wolnej i związanej Xantohumolu dla firmy biotechnologicznej.
- badanie metabolizmu wątrobowego nowych ksenobiotyków podczas inkubacji z frakcją mikrosomalną. Inkubacja z frakcją mikrosomalną jest jedną z trzech najpowszechniej stosowanych metod badania metabolizmu wątrobowego leków in vitro. Badanie polega na inkubacji badanego związku z frakcją mikrosomalną i kofaktorem (NADPH) w obecności jonów magnezu. Reakcję stopuje się po wybranym czasie przez strącenie białek zimnym ACN zawierającym odpowiedni standard wewnętrzny. Strącone białka są następnie odwirowywane, a supernatant jest analizowany za pomocą LC/MS. Rozkład związku jest oceniany na podstawie zmniejszania się stosunku powierzchni piku badanego związku do powierzchni piku standardu wewnętrznego. Standaryzacja protokołu była wykonana na Verapamil (metabolizowany przez izoformy P450s: 3A4, 3A5, 2C8) i Propranolol (metabolizowany przez izoformy P450s: 2D6, 1A2). Protokół w łatwy sposób może zostać rozszerzony o związki kontrolne dla innych izoform P450 oraz przystosowany do pracy z frakcją S9. Komercyjnie procedura była wykorzystana w sprawozdawanym okresie do oceny nowych związków syntezowanych przez firmę biotechnologiczną.
- we współpracy z dr hab Ewą Szolajską, IBB wdrożono analityczne części procedur PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) i inkubacji z komórkami CACO2. Obie te procedury służą do wstępnej oceny biodostępności in vitro. Pierwsza polega na badaniu przenikalności przez syntetyczną podwójną błonę lipidową na nośniku z włókien szklanych lub polimerowych. Druga polega na badaniu przenikania przez hodowaną in vitro monowarstwę komórek CACO2, pochodzących z ludzkiego gruczolaka okrężnicy, wykazujących wiele morfologicznych i biochemicznych podobieństw do komórek jelita - enterocytów.
- W ramach projektu zakupiono wysokowydajny, automatyczny homogenizator Bertin Percellys. Procedury homogenizacji opracowane przy jego użyciu były wielokrotnie używane zarówno w projektach naukowych jak i w oznaczeniach komercyjnych. Homogenizowane były różnego rodzaju tkanki zwierzęce i roślinne w celu oznaczeń zarówno związków endogennych jak i egzogennych. Procedury homogenizacji sąrutynowo wykorzystywane w analizach m.in. dla: prof. prof. Łobody, Olka, Ufnala, Mikuli, Hameda, firm biotech.
- analiza nukleotydo-cukrów oraz następnie pojedynczych nukleotydów - panele dla obu typu związków są wciąż poszerzane
- metoda analizy poliizoprenoidów w ekstraktach roślinnych oraz zwierzęcych. Opracowano nową metodę umożliwiającą separację prenolu i dolicholu o tej samej długości łańcucha na kolumnie chromatograficznej, dzięki czemu daje to wysoką specyficzność analizy. Metoda była stosowana już do wielu ekstraktów m.in. z osocza szczurzego, siatkówek mysich, kultur pantofelków czy organów roślinnych.
Technologia wymiany proton-deuter HDX.
- Metodyka badania własności strukturalnych produktów biopodobnych w obszarze leków białkowych – przeciwciał terapeutycznych poprzez porównywanie z wzorcowymi wzorami wymiany dla produktów oryginalnych. Została opracowana na przykładzie Herceptyny, jako podstawa do oceny jej biopodobnych produktów, takich jak Herzuma or Kanjiti. Opracowany generalny protokół może być łatwo zmodyfikowany celem zastosowania do przeciwciał terapeutycznych innych typów.
- Oprogramowanie do wysokopoziomowej analizy danych HDX usprawnione w toku projektu i wyposażone o szereg nowych funkcjonalności jest dostępne dla użytkowników pod adresem https://hadex2.mslab-ibb.pl/. Pozwala ono na opracowanie danych HDX w wybrany sposób ich prezentacji, ocenę jakości eksperymentu, porównywanie rezultatów dla kilku stanów. Towarzyszą mu autorskie procedury analiz danych poprzez dopasowanie modelu kinetycznego Zhanga i Smitha, opracowane w późniejszym okresie 2022-2024 https://hradex.mslab-ibb.pl/; https://compahradex.mslab-ibb.pl/.
Raport 01.11.2017 – 30.09.2018
Raport 01.10.2019 – 30.09.2020
Raport 01.10.2020 – 29.06.2021